Серологическая диагностика ревматоидного артрита
1
Серологическая диагностика ревматоидного артрита Антитела к циклическому цитруллиновому пептиду: высокоспецифичный маркер заболевания
2
«Окно возможностей» 2 Начало терапии Первый визит к ревматологу Первые симптомы Начало деструкции сустава Идеальный курс Без лечения Позднее начало Раннее начало лечения Время Через 2 года:Эрозивное поражение суставов у 90% больных Через 5 лет:Инвалидность у 40% больных Терапия ревматоидного артрита
3
Ревматоидный артрит: специфические аутоантигены 3 Антитела к цитруллинированным пептидам или белкам: Анти-перинуклеарный фактор (АПФ) Кератин Филаггрин ЦЦП (циклические цитруллиновые пептиды) Sa-антиген, MCV (цитруллинированный виментин) Фибриноген, фибрин -Енолаза CEP-1 (цитруллиновый пептид 1 альфа-енолазы)
4
Классификация РА Критерии ACR/EULAR, 2010 год 4 AПоражение суставов 1 большой сустав 2-10 больших суставов 1-3 малых суставов (в т.ч. без поражения больших суставов) 4-10 малых суставов (в т.ч. без поражения больших суставов) > 10 суставов (с поражением по крайней мере 1 малого сустава) BСерология (как минимум одно из перечисленного) РФ отрицательный и анти-ЦЦП отрицательный РФ или анти-ЦЦП слабо положительный РФ или анти-ЦЦП высоко положительный CМаркеры острой фазы (как минимум одно из перечисленного) СРБ и СОЭ в норме СРБ за пределами нормы 0101 DПродолжительность симптомов синовита
5
Специфические аутоантитела: анти-филаггрин 5 Клетки эпителия щеки Эпителий слизистой щек Анти-перинуклеарный фактор (1964 г.) Антитела к кератину, 1979 г. Аутоантитела к филаггрину Чувствительность: 35-80% Специфичность: 70-99% ЭПИТОПЫ?
6
Цитруллин 6 Дезиминирование остатков аргинина Аргинин Цитруллин АНТИГЕННЫЙ ЭПИТОП
7
Антигенный эпитоп: цитруллин 7 Walther J. van Venrooij Department of Autoimmune Biochemistry University of Nijmegen, Nijmegen, The Netherlands Цитруллин – важная составляющая часть эпитопов аутоантител, выявляемых при ревматоидном артрите
8
Цитруллинированные пептиды: история ИФА тест-системы 8 Выявляемые при ревматоидном артрите антитела распознают цитруллин-содержащие пептиды (ЦП) Выявление аутоантител к линейному ЦП Специфичность > 98%, но чувствительность 35-49% Выявление аутоантител к циклическому ЦП Специфичность > 98%, чувствительность > 70% Поиск оптимальных пептидов – тест-система 2 поколения – Anti-CCP2
9
Цитруллинированный пептид Чувствительность для РА: 49% CCP =Cyclic Citrullinated Peptide 68% = Цитруллин Линейный пептид (из молекулы филаггрина:) Schellekens et al., Arthritis Rheum, 2000 Циклический пептид:
10
Table 1 Specificity and sensitivity of the CCP2 test for RA van Venrooij, W. J. et al. (2011) Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future Nat. Rev. Rheumatol. doi: /nrrheum
11
Антитела к ЦЦП: выявляются задолго до появления симптомов РА 11 Rantapäa-Dahlqvist et al., Arthritis Rheum, 2003 Время до появления симптомов, годы Анти-CCP2 положит. 83 больных РА, все бывшие доноры крови Образцы сыворотки получены из банка крови – вплоть до 10 лет до появления первых симптомов
12
Анти-ЦЦП, тест 2 поколения: чувствительность и специфичность 12 Панель Anti-CCP2 ELISA nПоложит. Чувствительность для РА (78.5%) Доноры крови4002 (0.5%) Псориатрический артрит280 Другие формы артрита353 (8.6%) Системная красная волчанка1083 (2.8%) Синдром Шегрена1062 (1.9%) Системная склеродермия983 (3.1%) Аутоиммунный тиреоидит1594 (2.5%) Грануломатоз Вегенера251 (4.0%) Положительные на антитела к парвовирусу B (2.4%) Вирусные гепатиты540 ВИЧ-положительные50 Специфичность для РА (98.2%)
13
EUROIMMUN Калибратор 1 -верхняя граница измеряемого диапазона Калибратор 2 -верхняя граница нормальных значений Калибратор 5 -граница чувствительности теста ИФА тест-система фирмы EUROIMMUN КАЛИБРОВКА : НАДЕЖНО И ЭКОНОМИЧНО О
14
EUROIMMUN ИФА тест-система фирмы EUROIMMUN — калибратор 1 — положительный контроль — калибратор 2 — отрицательный контроль — калибратор 3 — калибратор 4 — калибратор 5 МЕТОДИКА : УДОБНО И БЫСТРО Инкубация: мин. (комн. темп.)
15
Серологическая диагностика РА 15 Схема, принятая в Германии При подозрении на РА: определение антител к ЦЦП (Anti- ССP-2) Рекомендуется: дополнительно – определение ревматоидного фактора, особенно класса IgM Определение анти-ЦЦП полезно: для прогнозирования эрозивного течения РА Определение анти-ЦЦП не слишком пригодно: — для мониторинга прогрессирования РА — для мониторинга ответа на терапию Может быть, более полезны: Anti-MCV?Anti-Sa?
16
Серологическая диагностика РА 16 Anti-MCV: чувствительность несколько выше, специфичность ниже ИсследованиеNAnti-MCVAnti-CCP РА Контрол. группа Чувств.Специф.Чувств.Специф. H.Bang Arthritis Rheum дон. 257 CTD 82 % 98 % 79 % 72% 96% — C. Dejaco Arthritis Res Therapy %91 %70 %99 % D. Coenen Clin Chem %90 %73 %97 % L. Soos J Rheumatol %92 %66 %98 % L. Mathsson Arthritis Rheum дон.71 %95 %58 %96 % R. Sghiri Rheumatol Int %79 %72 %96 %
17
Серологическая диагностика РА 17 Тест-системаАнтиген Чувств.[%] (n=100 больных РА) Специф. [%] (n=202) AUC Чувств. [%] при 98% специфичности EUROIMMUNCCP PhadiaCCP Axis ShieldCCP EurodiagnosticaCCP Inova 2. Generation CCP Inova 3. Generation CCP Inova 3.1. Generation CCP Genesis Цитруллин. филаггрин OrgentecMCV Astra Цитруллин.пептид ВЭБ RF-TestIgG AeskuЦитруллин. IgG ( Bizzarro et al., Clinical Chemistry, 2007)
18
Серологическая диагностика РА 18 Что дает определение антител к ЦЦП? Диагностика РА: высокая специфичность и чувствительность Прогнозирование появления симптомов (у асимптоматических доноров крови, при недифференцированных артритах и т.д.) Прогнозирование эрозивных форм Но: Низкая степень корреляции с активностью процесса Sa-антиген?
19
Sa-антиген 19 Kindly provided by H. Ménard Стрипы 3-4 – анти-Sa-антиген
20
Анти-SA: тест-система EUROIMMUN 20 Сходимость: 98.5% Lora et al., 9th Dresden Symposium on Autoantibodies, Germany, September 2009
21
Анти-Sa и анти-CCP: чувствительность и специфичность 21 Исследование: проф. Й. Венковски, Пражский университет / EUROIMMUN ВыборкаnAnti-SaAnti-CCP2 РА (48.1%)157 (66.2%) Ранний РА74 28 (37.8%) 44 (59.5%) ЮИA561 (1.8%)2 (3.6%) Чувствительность для РА % 66.2% СКВ1902 (1.1%)8 (4.2%) Псориатический артрит (1.7%) Специфичность %97.0% Доноры4083 (0.7%)2 (0.5%)
22
Анти-Sa: прогностический маркер при раннем РА 22 Langer et al., 7th International Congress on Autoimmunity, Ljubljana, May 5-9, 2010 Выборка Anti-Sa positive (n=10) Anti-CCP positive (n=20) Anti-MCV positive (n=39) RG 10 (0%)1 (5%)7 (18%) RG 20 (0%)1 (5%)8 (21%) RG 31 (10%)2 (10%)5 (13%) RG 49 (90%)16 (80%)19 (49%) Группы риска (модифицированный счет Виссера): RG 1:благоприятный прогноз (вероятность эрозивного РА
23
Анти-Sa: прогностический маркер при раннем РА 23 Langer et al., 7th International Congress on Autoimmunity, Ljubljana, May 5-9, 2010 Положительное прогностическое значение (PPV) для плохого прогноза: анти-Sa 90% анти-CCP80% анти-MCV49%
24
Анти-Sa: прогностический маркер при раннем РА РЕЗЮМЕ Анти-Sa обнаружены только у больных с неблагоприятным и плохим прогнозом (10% в группе риска 3, 90% в группе риска 4) PPV для плохого прогноза (группа риска 4): 90% анти-Sa, 80% анти-CCP, 49% анти-MCV 20% положительных на анти-Sa образцов были отрицательны как на анти-CCP, так и на анти-MCV. 1) Анти-Sa: преимущество в прогнозировании тяжелого течения РА 2) Анти-Sa позволяет выявить ряд больных, отрицательных на анти-CCP и анти-MCV Langer et al., 7th International Congress on Autoimmunity, Ljubljana, May 5-9, 2010
25
Анти-CCP и анти-Sa 25 Выводы Чувствительность: анти-ЦЦП>> анти-Sa Специфичность: анти-Sa > анти-ЦЦП Прогноз тяжелого течения: анти-Sa > анти-ЦЦП Анти-ЦЦП – основной диагностический маркер Анти-Sa – дополнительный показатель ИФА наборы EUROIMMUN для выявления IgG к ЦЦП и Sa-антигену
26
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ! Зайко Сергей Дмитриевич Сентябрь 2011 г.
Источник
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой наиболее частое воспалительное заболевание суставов. В северо-европейской популяции его встречаемость достигает более 1%. Ревматоидный артрит представляет собой системное аутоиммунное заболевание, основным признаком которого является воспаление синовиальных оболочек суставов. В отсутствии специфической терапии он характеризуется неумолимым прогрессирующим течением, хотя периоды ярких клинических проявлений чередуются с периодами относительного улучшения. Последствиями ревматоидного артрита является деградация суставного хряща, с последующей эрозией кости, приводящие к значительному разрушению сустава с потерей его функции. Кроме клиники деформирующего артрита, у 20% больных отмечаются внесуставные проявления заболевания.
Иммунологическое обследование особенно актуально на ранних стадиях болезни, когда серологическое обследование явлется единственным доступным методом объективизации клинических предположений Часто нетипичная клиническая картина в начале заболевания, например олигоартрит и отсутствие костных эрозий, несмотря на длительность жалоб пациента, а также тот факт, что применение активной терапии в дебюте заболевания может замедлить быстрое развитие деформаций суставов, делают лабораторные тесты чрезвычайно ценным инструментом дифференциальной диагностики в дебюте РА. Важно подчеркнуть, что корректный диагноз РА, поставленный на раннем этапе является основной проведения эффективной иммуносупрессивной терапии.
Ревматоидный фактор.
Дешевизна и доступность определения ревматоидного фактора (РФ) делают его первым серологическим тестом в обследовании пациентов с заболеваниями суставов. Выявление РФ в клинических лабораториях основано на использовании методов латекс-агглютинации и турбидиметрии. Хотя турбидиметрия представляет более чувствительный метод, однако ее сравнительно высокая чувствительность снижает специфичность обследования. Считаем целесообразным использовать в качестве скрининга латексный метод определения РФ, что значительно удешевляет обследование больных. При этом чувствительность латексного теста должна составлять не более 20-25 МЕ/мл. Положительные результаты латексных тестов может быть подтвержден количественными турбидиметрическими методами.Дополнительным методом серологической диагностики ревматоидного артрита является определение ревматоидного фактора (РФ) класса IgA, методом иммуноферментного анализа.
Отсутствие РФ при первом обследовании не исключает диагноза серонегативного РА. Однократное определение РФ на ранней стадии РА, принесшее отрицательный результат, недостаточно для того чтобы исключить ранний РА. Если диагноз РА подозревается или даже клинически подтвержден при отрицательном результате теста по определению РФ, требуются повторное определения его титра через 12 месяцев для определения серопозитивной формы этого заболевания. Этот срок приблизительно соответствует времени обновления пула плазматических клеток, способных синтезировать аутоантитела. Если же будет получен положительный результат, то нет реальных предпосылок повторять определение РФ с течением времени, если только не проводится биологическая терапия. В случае длительной ремиссии заболевания титры РФ снижаются ниже детектируемых. Надо отметить, что большое время полужизни сывороточного иммуноглобулина, а также постоянство иммунных ответов не позволяет использовать серологические маркеры для мониторинга течения заболевания, поэтому для мониторинга рекомендуется использовать острофазовые реактанты (СОЭ и/или СРБ), а также маркеры деструкции костной и хрящевой ткани.
Антицитруллиновые антитела.
В диагностике раннего РА необходимо всегда дополнять выявление РФ выявлением антицитруллиновых антител (АЦА). Среди антицитруллиновых антител наилучшими клинико-лабораторными параметрами обладают антитела к циклическому цитруллиновому пептиду (АЦЦП/anti-CCP) и антитела к модифицированному цитруллиннированному виментину (АМЦВ/anti-MCV) .
Наибольшей чувствительностью при обследовании пациентов всех категорий обладает совместное выявление ревматоидного фактора и антител к модифицированному цитруллинированному виментину (АМЦВ/MCV) — скрининг ревматоидного артрита тест. АМЦВ/MCV более чувствительный маркер ревматоидного артрита и чаще отмечается у пациентов РА серонегативных по ревматоидному фактору. При использовании сочетания РФ и анти-MCV у 85-95% больных РА удается выявить, по крайней мере, одну из разновидностей этих антител, а отсутствие всех маркеров свидетельствует об исключении диагноза РА на любом этапе этого заболевания.
Благодаря высокой специфичности наилучшими параметрами для ранней диагностики обладают антитела к циклическому цитруллиновому петиду( АЦЦП/ССР), так как их выявление имеет высокий фактор риска, т.е. его обнаружение повышает вероятность заболевания в 15 раз и обладает очень высоким предсказательным значением положительного результата. Рекомендуется использовать определение АЦЦП при проведении дифференциального диагноза ревматоидного артрита и других ревматических заболеваний (СКВ, псориатического артрита и других сернегативных артропатий, подагры).
Для оценки прогноза мы используем выявление антикератиновых антител (АКА). Ряд исследований, проведенных в нашей лаборатории, указывает на то, что АКА предсказывают развитие деструктивного процесса в суставах и пациенты с высокими титрами АКА требуют более активной иммуносупрессивной терапии. Высокоспецифическим маркером РА являются антиперинуклеарные антитела, также относящиеся к группе АЦА, выявляемые с помощью непрямой иммунофлюоресценции на субстрате пищевода крысы.
HLA генотипирование при ревматоидном артрите.
Нужно отметить, что РА ассоциирован с определенными аллелями HLA. HLA гены являются частью главного комплекса гистосовместимости и принимают активное участие в формировании иммунного ответа. Эти гены представлены в организме в гаплоидном наборе и, соответственно, могут являться гомо- или гетерозиготой. Для ранней диагностики РА необходимо выявление генов локуса HLA-DRB1. Наиболее значимыми среди них являются гены из групп DRB1*01 и DRB1*04, т.к. в экспрессированных молекулах содержат SE (общий эпитоп), презентирующий циклический цитруллинированный пептид клеткам иммунной системы. У больных РА, несущих гены группы DRB1*01, а именно аллельный ген DRB1*01:01, который составляют 86% от аллельной группы чаще развивается серопозитивный РА с быстрой деструкцией суставов. Наличие этого гена в геноме обязательно, однако недостаточно для развития серопозитивного РА у человека. Группа аллельных генов HLA-DRB1*01 отмечается у 29% пациентов с серопозитивным РА, сопровождающимся антителами к цитруллированным антигенам и ревматоидному фактору.
Степень деструкции хряща.
Определение концентрации хрящевого олигомерного белка (СОМР) позволяет оценить степень деструкции хряща. Сывороточная концентрация СОМР может использоваться как ранний и перспективный маркер ремоделирования суставного хряща. Высокие концентрации COMP указывают на быструю деструкцию хрящевой ткани при остеартрите и других хронических артритах. Исследование уровня СОМР следует использовать при мониторинге эффективности терапии ревматоидного артрита и остеоартроза. Одновременное определение маркеров хрящевой деструкции и воспаления позволяет проводить адаптировать терапию заболеваний суставов с учетом варианта поражения и скорости разрушения суставного хряща.
В качестве дифференциального диагноза диагноза РА часто рассматриваются серонегативные спондилоартропатии.
Серонегативные спондилоартропатии.
Антиген HLAB27 встречается у большинства лиц заболевших серонегативными спондилоартропатями. Эта разнородная группа заболеваний, в которую входят: анкилозирующий споднилит, псориатический артрит, реактивный артрит, синдром Рейтера, артрит при воспалительных заболеваниях кишечника, рецидивирующем увеите, ювенильном ревматоидном артрите. В клинической симптоматике всех этих заболеваний отмечается артрит периферических суставов и суставов осевого скелета, кроме того при этих заболеваниях обычно не находят ревматоидный фактор и другие аутоантитела, именно последний феномен позволяет назвать их «серонегативными». Совокупная встречаемость этих заболеваний в популяции составляет около 0,5%, что позволяет отнести их к часто встречающимся аутоиммунным заболеваниям.
Продукты генов системы HLA (человеческие лейкоцитарные антигены), расположенной на 6 хромосоме, захватывают и представляют чужеродные антигены в иммунной системе, что приводит к запуску специфических иммунных ответов. Гены этой системы отличаются разнообразием, что обеспечивает контроль всех иммунных ответов, в том числе аутоиммунных. Причиной индукции ряда аутоиммунных заболеваний являются определенные аллели (варианты) генов системы HLA, которые перекрестно презентируют экзогенные анитигены аутореактивным лимфоцитам.
Роль молекулы HLAB27 в патогенезе серонегативных спондилоартропатий окончательно не установлена. Основной гипотезой является «молекулярная мимикрия» антигенов, в результате которой молекулы HLA-B27 извращенно презентируют антигены ряда бактерий желудочно-кишечного или урогенитального трактов с развитием аутоиммунной реакции. Существует несколько аллельных изоформ HLAB27, однако все они с равной степенью связаны с серонегативными спондилоартропатиями.
Кристаллопатии и подагра.
Нарушение обмена пуриновых оснований в организме при подагре приводит к повышению содержания мочевой кислоты в крови и синовиальной жидкости. Острый приступ подагрического артрита сопровождается кристаллизацией солей с образованием кристаллов моноурата натрия. Прямое обнаружение кристаллов возможно при проведении исследования суставной жидкости. Тонкие игловидные кристаллы моноурата натрия могут быть расположены внутри и внеклеточно. При исследовании в поляризованном свете они могут быть идентифицированы благодаря характерному отрицательному двойному лучепреломлению.
Другой формой микрокристаллического артрита является псевдоподагра, которая сопровождается формированием кристаллов пирофосфата кальция. Кристаллы образуются под действием фермента нуклеозидтрифосфат пирофосфорилазы, который при остеоартрозе синтезируется в суставном хряще. В отличии от моноурата натрия, кристаллы пирофосфота кальция при пирофосфатной артропатии, толще и короче, ромбовидной формы и обладают положительным двойным лучепреломлением.
Источник
